Prosedur Pemeriksaan ELISA

Prosedur Pemeriksaan ELISA dengan Metode Sandwich

Preparasi Sampel

• Sampel Serum

Setelah whole blood diambil, biarkan darah untuk membeku pada suhu ruangan selama 10-20 menit. Kemudian sentrifuge dengan kecepatan 2000-3000 rpm selama 20 menit. Kemudian supernatan diambil dan dapat digunakan sebagai sampel uji.

• Sampel Plasma

Kumpulkan whole blood pada tabung yang telah berisi antikoagulan (EDTA atau sitrat). Setelah diinkubasi pada suhu ruangan selama 10-20 menit, tabung disentrifuge selama 20 menit dengan kecepatan 2000-3000 rpm. Kemudian supernatan diambil dan dapat digunakan sebagai sampel uji.

• Sampel Urin/ Cairan Serebrospinal/ Cairan Pleuroperitoneal

Kumpulkan urin dalam tabung kontainer yang aseptik. Selanjutnya, dilakukan sentrifuge dengan kecepatan 2000-3000 rpm selama 20 menit. Kemudian supernatan diambil dan dapat digunakan sebagai sampel uji.

• Sampel Sel

Apabila akan dilakukan deteksi pada sekresi sel, lakukan pengumpulan supernatan kultur kedalam tabung kontainer yang aseptik, setelah dilakukan sentrifuge 2000-3000 rpm selama 20 menit. Apabila akan dilakukan deteksi komponen intraselular, maka sel 1×10⁶ /mL dalam PBS (pH 7,2-7,4). Sel dihancurkan untuk mengeluarkan komponen sel dengan melakukan pembekuan dan pencairan sampel secara berulang. Selanjutnya, dilakukan sentrifuge 2000-3000 rpm, selama 20 menit dan supernatan diambil dan digunakan sebagai sampel uji.

• Sampel Jaringan

Sampel jaringan dipotong dan ditimbang, selanjutnya jaringan ditambahkan dengan PBS (pH 7,4). Kemudian sampel jaringan dihomogenisasi (dihancurkan) dalam kondisi dingin, 4^oC. Selanjutnya, dilakukan sentrifuge dengan kecepatan 2000-3000 rpm, selama 20 menit. Kemudian supernatan diambil dan dapat digunakan sebagai sampel uji.

Sampel ELISA sebaiknya segera digunakan. Apabila sampel akan disimpan terlebih dahulu, maka sampel dapat disimpan pada suhu -20^oC. Pengulangan pembekuan dan pencairan sampel sebaiknya jangan dilakukan berulang.

Cara Mudah Pemeriksaan ELISA Seri 2, KLIK DISINI

Bahan yang akan digunakan :

            Bahan yang akan digunakan disesuaikan dengan kit yang akan digunakan. Adapun bahan yang digunakan :

• Mikroplate ELISA
• Standard
• Standard diluent
• Blocking Buffer
• Sampel diluent
• Biotinylated Antibodi
• Capture Antibodi
• ABC
• HRP
• TMB
• Stop Solution
• Wash Solution

Tahapan Pemeriksaan :

1. Pembuatan standard

Sepuluh sumuran pada mikroplate disiapkan untuk standard. Pada sumuran 1 dan 2, masukkan 100 ul standard dan 50 ul standard diluent, kemudian dicampur. Pada sumuran 3 dan 4, masukkan 100 ul cairan dari sumuran 1 dan 2 dan 50 ul standard diluent, kemudian dicampur. Pada sumuran 5 dan 6, masukkan 100 ul cairan dari sumuran 3 dan 4 dan 50 ul standard diluent, kemudian dicampur. Pada sumuran 7 dan 8, masukkan 100 ul cairan dari sumuran 5 dan 6 dan 50 ul standard diluent, kemudian dicampur. Pada sumuran 9 dan 10, masukkan 100 ul cairan dari sumuran 7 dan 8 dan 50 ul standard diluent, kemudian dicampur.

2. Ditambahkan Capture antibodi pada tiap sumuran. Kemudian dilakukan inkubasi selama 30 menit pada suhu 37^oC atau selama semalam pada suhu 4^oC.
3. Persiapan wash solution : larutkan wash solution 30x dengan aquadest (1 ml wash solution ditambahkan 29 ml aquadest).
4. Selanjutnya, buang cairan dari sumuran dan cuci sumuran sebanyak 5 kali dengan larutan pencuci yang telah disiapkan pada tahap 3.
5. Ditambahkan blocking buffer, untuk membuat antigen pada sampel menempel pada plate.
6. Inkubasi plate selama 60 menit, pada suhu 37^oC atau selama semalam pada suhu 4^oC.
7. Persiapan sampel. Masukkan 10 ul sampel dan 40 ul sampel diluent ke tiap sumuran. Sampel sebaiknya langsung dimasukkan ke dasar sumuran. Selanjutnya, dilakukan pencampuran sehingga sampel dan sampel diluent tercampur dengan baik.

8. Inkubasi plate selama 120 menit pada suhu ruangan.
9. Tambahkan 100 ul  biotinylated antibodi pada tiap sumuran.
10. Inkubasi plate selama 60 menit, pada suhu 37^oC atau selama semalam pada suhu 4^oC.
11. Selanjutnya, buang cairan dari sumuran dan cuci sumuran sebanyak 5 kali dengan larutan pencuci yang telah disiapkan pada tahap 3.
12. Tambahkan 100 ul ABC solution pada tiap sumuran.
13. Inkubasi selama 30 menit pada suhu 37^oC.
14. Selanjutnya, buang cairan dari sumuran dan cuci sumuran sebanyak 5 kali dengan larutan pencuci yang telah disiapkan pada tahap 3.
15. Kemudian ditambahkan 90 ul HRP-conjugate dan 90 ul TMB pada tiap sumuran.
16. Inkubasi plate selama 30 menit, pada suhu 37^oC.
17. Selanjutnya, ditambahkan 100 ul stop solution pada tiap sumuran, sehingga akan terjadi perubahan warna dari biru menjadi kuning.
18. Selanjutnya, baca nilai OD pada panjang gelombang 450 nm pada ELISA reader.
19. Selanjutnya, akan didapatkan nilai OD dari sampel.

Apabila pembaca mendapatkan informasi dan ilmu dari artikel ini, mohon kiranya bersedia untuk mengapresiasi serta berdonasi bagi kemajuan ilmu pengetahuan, cukup dengan klik salah satu iklan di halaman ini atau website ini.